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介绍
通常情况下基因表达研究如微阵列和RNA-Seq会产生数百到数千个差异表达基因deg。理解如此庞大的数据集的生物学意义变得非常困难尤其是在分析多个条件和比较的情况下。该软件包利用途径富集和蛋白-蛋白相互作用网络促进了差异基因表达结果的可视化和下游分析帮助研究人员从基因表达研究中发现潜在的生物学和病理生理学。
我们在这个包中包含了一个基因表达结果的示例数据集作为对象“exampleDESeqResults”。这是一个由2个数据帧组成的列表使用包中的‘ results() ’函数生成BiocStyle::Biocpkg“DESeq2”’ Love et al. 2014。数据来自一项RNA-Seq研究该研究调查了入院时T1的COVID-19和非COVID-19败血症患者与大约1周后T2在ICU的情况并随时间索引即T2 vs T1 an et al. 2023。
安装
安装该R包
# Well also be using some functions from dplyr
# BiocManager::install(pathlinkR, versiondevel)
library(dplyr)
library(pathlinkR)基因表达火山图
在基因表达研究中通常首先进行的可视化分析之一是识别差异表达基因DEGs的数量。这些基因通常是通过设定特定的倍数变化和统计显著性阈值来定义的。调整后的p值小于0.05和绝对倍数变化大于1.5被用作默认阈值尽管可以指定任何值。pathlinkR 包含了一个名为 eruption() 的函数用于创建火山图。
data(exampleDESeqResults)eruption(rnaseqResultexampleDESeqResults[[1]],titlenames(exampleDESeqResults[1])
)对于定制火山图有多种选项可供选择包括
调整阈值切换显著基因和非显著基因的颜色改变标记基因的数量调整x轴和y轴的范围绘制对数2log2或非对数2的倍数变化以更好地感知变化幅度突出显示特定感兴趣的基因集
data(sigoraDatabase)
interferonGenes - sigoraDatabase %% filter(pathwayName Interferon Signaling) %% pull(ensemblGeneId)eruption(rnaseqResultexampleDESeqResults[[1]],titlenames(exampleDESeqResults[1]),highlightGenesinterferonGenes,highlightNameInterferon genes (red),labelhighlight,nonlog2TRUE,n10
)可视化比较中的倍数变化
除了创建火山图外我们还可以通过热图来可视化特定通路例如通过pathwayEnrichment()识别为显著的通路中涉及的差异表达基因DEGs。plotFoldChange()函数通过接收DESeq2::results()数据框的输入列表与pathwayEnrichment()类似并为组成基因的倍数变化创建热图来实现这一点。
plotFoldChange(inputListexampleDESeqResults,pathNameInterferon alpha/beta signaling
)为了定制化提供了多种选项包括
缩短每次比较的名称提供一个自定义的基因列表进行可视化并添加一个信息性的标题在热图单元格中使用对数2倍数变化交换默认的行和列并在行比较之间添加分隔
exampleDESeqResultsRenamed - setNames(exampleDESeqResults,c(Pos, Neg)
)plotFoldChange(exampleDESeqResultsRenamed,manualTitleSignature genes,genesToPlotc(CD4, CD8A,CD8B, CD28, ZAP70),geneFormathgnc,colSplitc(Pos, Neg),log2FoldChangeTRUE,colAngle45,clusterRowsFALSE,clusterColumnsTRUE,invertTRUE
)构建和可视化蛋白质-蛋白质相互作用网络
pathlinkR 包含用于构建和可视化蛋白质-蛋白质相互作用PPI网络的工具。在这里我们利用从 InnateDB 收集的 PPI 数据生成在基因表达分析中识别的差异表达基因DEGs之间的相互作用列表。这些相互作用随后可以在 R 中用于构建 PPI 网络同时提供了多种选项来控制网络的类型例如支持一级、最小或零级网络。实现这一目标的两个主要函数是 ppiBuildNetwork() 和 ppiPlotNetwork()。
让我们继续查看 COVID 阳性患者随时间变化的差异表达基因DEGs使用显著的 DEGs 来构建一个 PPI 网络。由于我们输入的数据框包含了所有测量的基因而不仅仅是显著的基因我们将使用 filterInputTRUE 选项以确保网络仅由通过标准阈值如上所述的基因构建。由于我们正在可视化 DEGs 的网络让我们通过指定 fillTypefoldChange 来给节点上色以指示它们失调的方向即上调或下调。
exNetwork - ppiBuildNetwork(rnaseqResultexampleDESeqResults[[1]],filterInputTRUE,orderzero
)ppiPlotNetwork(networkexNetwork,titlenames(exampleDESeqResults)[1],fillColumnLogFoldChange,fillTypefoldChange,labelTRUE,labelColumnhgncSymbol,legendTRUE
)带有蓝色标签的节点例如STAT1、FBXO6、CDH1等是网络中的枢纽节点即那些具有高介数中心性得分的基因。用于确定枢纽节点的统计量可以在ppiBuildNetwork()函数中通过“hubMeasure”选项进行设置。
exNetworkInterferon - mutate(exNetwork,isInterferon if_else(name %in% interferonGenes, y, n)
)ppiPlotNetwork(networkexNetworkInterferon,titlenames(exampleDESeqResults)[1],fillColumnisInterferon,fillTypecategorical,catFillColoursc(yred, ngrey),labelTRUE,labelColumnhgncSymbol,legendTRUE,legendTitleInterferon\ngenes
)富集网络和提取子网络
pathlinkR 包含两个用于进一步分析蛋白质-蛋白质相互作用PPI网络的函数。首先ppiEnrichNetwork() 函数会使用网络的节点表来测试富集的 Reactome 通路或 Hallmark 基因集。
exNetworkPathways - ppiEnrichNetwork(networkexNetwork,analysishallmark,filterResultsdefault,geneUniverse rownames(exampleDESeqResults[[1]])
)exNetworkPathways其次ppiExtractSubnetwork() 函数可以从起始网络中提取一个最小连通的子网络使用富集通路中的基因作为提取的“起始”节点。例如下面我们将使用上述 Hallmark 富集的结果从“干扰素γ反应”项中提取一个基因子网络然后绘制这个缩减后的网络并突出显示通路中的基因。
exSubnetwork - ppiExtractSubnetwork(networkexNetwork,pathwayEnrichmentResultexNetworkPathways,pathwayToExtractINTERFERON GAMMA RESPONSE
)ppiPlotNetwork(networkexSubnetwork,fillTypeoneSided,fillColumndegree,labelTRUE,labelColumnhgncSymbol,legendTitleDegree
)或者您也可以使用ppiExtractSubnetwork()函数中的genesToExtract参数提供您自己的基因集一个包含Ensembl ID的字符向量来提取为子网络。
进行通路富集分析
通路富集的核心概念是过度表达也就是说我们差异表达基因DEG列表中属于特定通路的基因数量是否比随机情况下预期的更多为了计算这一点最简单的方法是比较某个通路中的 DEGs 与所有 DEGs 的比例以及数据库中所有通路中的基因与该通路中所有基因的比例。pathlinkR 主要使用 Reactome 数据库Fabregat 等2017来实现这一目的。
过度表达分析可能出现的一个问题是假设每个通路中的每个基因在属于该通路方面具有“相等”的价值。实际上一种蛋白质可以具有多种有时是非常不同的功能并且属于多个通路例如蛋白激酶。还有一些通路与细胞机制有相当大的重叠如 TLR 通路。这可能导致多个相似通路或甚至不相关的“假阳性”富集使得解析结果变得非常困难。
一种解决方案是使用独特的基因对正如 r BiocStyle::CRANpkg(sigora) 包的创建者所描述的Foroushani 等2013。这种方法减少了由于多面性基因导致的相似和不相关通路的数量更多地关注可能与基础生物学相关的通路。这种方法是 pathlinkR 中 pathwayEnrichment() 函数的默认方法。
pathwayEnrichment() 函数的输入是一个数据框列表每个来自 DESeq2::results()默认情况下会将基因分为上调和下调两类然后分别对每组进行通路富集分析。列表中数据框的名称应表明在 DESeq2 结果中进行的比较因为它将用于识别结果。对于 analysissigora我们还需要提供一个基因对签名库gpsRepo其中包含要测试的通路和基因对。将此参数保留为“默认”将使用 sigora 中的 reaH GPS 库包含人类 Reactome 通路。或者也可以提供自己的 GPS 库有关如何制作的详细信息请参阅 ??sigora::makeGPS()。
## Note the structure of exampleDESeqResults: a named list of results from
## DESeq2
exampleDESeqResultsenrichedResultsSigora - pathwayEnrichment(inputListexampleDESeqResults,analysissigora,filterInputTRUE,gpsRepodefault
)head(enrichedResultsSigora)对于那些仍然倾向于传统的过度表达分析的人我们提供了通过设置analysisreactome来使用r BiocStyle::Biocpkg(ReactomePA)Yu 等2016进行分析的选项。在使用这种方法时我们建议提供一个基因全集作为富集测试的背景这里我们将使用 DESeq2 测试显著性的所有基因即计数矩阵中的所有基因在运行测试之前将它们转换为 Entrez 基因 ID。详情请参阅我们的 Github 页面 上的完整手册。
除了在设置analysis为“sigora”或“reactome”时使用的 Reactome 数据库外我们还提供了使用 Molecular Signatures Database (MSigDb) 中的 Hallmark 基因集 进行过度表达分析。这些是 50 个基因集代表“具有协调表达的特定、明确定义的生物学状态或过程”Liberzon 等2015。与更细致的 Reactome 通路相比这个数据库提供了关于关键生物学过程的更高级别的总结
enrichedResultsHm - pathwayEnrichment(inputListexampleDESeqResults,analysishallmark,filterInputTRUE,splitTRUE
)head(enrichedResultsHm)最后用户在进行富集分析时也可以使用来自 KEGG 的数据。通过设置analysiskegg可以使用传统的过度表达分析或者通过指定analysissigora和gpsRepokegH可以使用基于基因对的方法。
绘制通路富集分析结果
现在我们已经得到了来自多个比较的大量通路富集分析结果是时候将它们可视化了。plotPathways()函数通过将Reactome通路或Hallmark基因集分组到父组下并指示每个通路在每个比较中是上调还是下调从而帮助我们轻松识别哪些通路在不同的差异表达基因DEG列表中是共享的或独特的。由于通常会有许多通路您可以将绘图分成多列最多3列并截断通路名称以使结果更容易展示。
有时一个通路可能在同一个DEG列表中的上调和下调基因中都富集这种情况通常发生在较大的通路中。这种现象会用一个白色星号表示其中显示更显著调整后的p值更低的方向。您还可以更改比较的角度/标签或者在标签下方添加每个比较中的DEG数量。最后您可以指定要包含在可视化的通路或顶级通路组。
pathwayPlots(pathwayEnrichmentResultsenrichedResultsSigora, columns2
)这些绘图也可以进行多种调整
基于顶级通路分组仅显示与免疫相关的通路改变用于调整后p值的颜色缩放压缩比较名称以便更好地适应绘图并使其水平显示在比较名称下方添加用于富集的DEGs数量增加通路名称的截断截止值以便显示更多单词
从这些结果中你可以看到尽管许多免疫系统通路在COVID-19和非COVID-19脓毒症患者中随时间朝同一方向变化但有一些独特的通路脱颖而出大多与干扰素信号传导有关“干扰素信号传导”、“干扰素γ信号传导”、“干扰素α/β信号传导”、“ISG15抗病毒机制”。这可能反映了COVID-19患者早期抗病毒反应的增强这种反应随时间减弱而非COVID-19脓毒症患者则没有变化。
pathwayPlots(pathwayEnrichmentResultsenrichedResultsSigora,specificTopPathwaysImmune System,colourValuesc(#440154, #FDE725),newGroupNamesc(COVID\nPositive, COVID\nNegative),showNumGenesTRUE,xAnglehorizontal,nameWidth50
)从富集通路生成网络
pathlinkR 包含将基于 Reactome 的方法“sigora”或“reactomepa”的通路富集结果转换为网络的函数通过计算分配给每个通路的基因的重叠来确定它们之间的相似性。在这些网络中每个通路是一个节点它们之间的连接或边是通过距离度量来确定的。可以设置一个阈值当两个通路之间的相似性达到最小值时它们被认为是相连的并且会在它们的节点之间绘制一条边。
我们提供了一个预先计算好的 Reactome 通路距离矩阵该矩阵是使用 Jaccard 距离生成的但也支持使用多种距离度量。一旦创建了这个通路相互作用的“基础”就可以使用 createPathnet() 函数构建通路网络
data(sigoraDatabase)pathwayDistancesJaccard - getPathwayDistances(pathwayData sigoraDatabase)startingPathways - pathnetFoundation(matpathwayDistancesJaccard,maxDistance0.8
)# Get the enriched pathways from the COVID Pos Over Time comparison
exPathwayNetworkInput - enrichedResultsSigora %% filter(comparison COVID Pos Over Time)myPathwayNetwork - pathnetCreate(pathwayEnrichmentResultexPathwayNetworkInput,foundationstartingPathways
)另一种可视化方法
pathnetGGraph(myPathwayNetwork,labelProp0.1,nodeLabelSize3,nodeLabelOverlaps8,segColourred,themeBaseSize 12
)填充的节点通路是富集的通路即由pathwayEnrichment()输出的通路。节点的大小与统计显著性相关而边的厚度与两个相连通路的相似性有关。
pathnetVisNetwork(myPathwayNetwork)仅使用差异表达基因DEGs生成通路网络
另一种选择是在生成通路网络信息时仅使用差异表达基因DEGs具体方法如下
candidateData - sigoraExamples %%filter(comparison COVID Pos Over Time) %% select(pathwayId, genes) %%tidyr::separate_rows(genes, sep;) %%left_join(sigoraDatabase,byc(pathwayId, genes hgncSymbol),multipleall) %%relocate(pathwayId, ensemblGeneId, hgncSymbolgenes, pathwayName) %%distinct()## Now that we have a smaller table in the same format as sigoraDatabase, we
## can construct our own matrix of pathway distances
candidateDistData - getPathwayDistances(pathwayDatacandidateData,distMethodjaccard
)candidateStartingPathways - pathnetFoundation(matcandidateDistData,maxDistance0.9
)candidatesAsNetwork - pathnetCreate(pathwayEnrichmentResultfilter(sigoraExamples, comparison COVID Pos Over Time),foundationcandidateStartingPathways,trimFALSE
)pathnetVisNetwork(candidatesAsNetwork, nodeLabelSize30)系统信息
R version 4.4.1 (2024-06-14)
Platform: x86_64-pc-linux-gnu
Running under: Ubuntu 22.04.5 LTSMatrix products: default
BLAS: /usr/lib/x86_64-linux-gnu/blas/libblas.so.3.10.0
LAPACK: /usr/lib/x86_64-linux-gnu/lapack/liblapack.so.3.10.0locale:[1] LC_CTYPEen_CA.UTF-8 LC_NUMERICC [3] LC_TIMEen_CA.UTF-8 LC_COLLATEen_CA.UTF-8 [5] LC_MONETARYen_CA.UTF-8 LC_MESSAGESen_CA.UTF-8 [7] LC_PAPERen_CA.UTF-8 LC_NAMEC [9] LC_ADDRESSC LC_TELEPHONEC
[11] LC_MEASUREMENTen_CA.UTF-8 LC_IDENTIFICATIONC time zone: America/Vancouver
tzcode source: system (glibc)attached base packages:
[1] stats4 stats graphics grDevices utils datasets methods
[8] base other attached packages:[1] DESeq2_1.46.0 SummarizedExperiment_1.36.0[3] Biobase_2.66.0 MatrixGenerics_1.18.0 [5] matrixStats_1.4.1 GenomicRanges_1.58.0 [7] GenomeInfoDb_1.42.0 IRanges_2.40.0 [9] S4Vectors_0.44.0 BiocGenerics_0.52.0
[11] pathlinkR_1.2.0 dplyr_1.1.4
[13] BiocStyle_2.34.0 loaded via a namespace (and not attached):[1] RColorBrewer_1.1-3 rstudioapi_0.17.1 jsonlite_1.8.9 [4] shape_1.4.6.1 magrittr_2.0.3 ggtangle_0.0.4 [7] magick_2.8.5 farver_2.1.2 rmarkdown_2.28 [10] GlobalOptions_0.1.2 fs_1.6.5 zlibbioc_1.52.0 [13] vctrs_0.6.5 memoise_2.0.1 ggtree_3.14.0 [16] rstatix_0.7.2 tinytex_0.53 htmltools_0.5.8.1 [19] S4Arrays_1.6.0 broom_1.0.7 Formula_1.2-5 [22] gridGraphics_0.5-1 SparseArray_1.6.0 sass_0.4.9 [25] bslib_0.8.0 htmlwidgets_1.6.4 plyr_1.8.9 [28] cachem_1.1.0 igraph_2.1.1 lifecycle_1.0.4 [31] iterators_1.0.14 pkgconfig_2.0.3 gson_0.1.0 [34] Matrix_1.7-1 R6_2.5.1 fastmap_1.2.0 [37] GenomeInfoDbData_1.2.13 clue_0.3-65 aplot_0.2.3 [40] enrichplot_1.26.1 digest_0.6.37 colorspace_2.1-1 [43] patchwork_1.3.0 AnnotationDbi_1.68.0 RSQLite_2.3.7 [46] ggpubr_0.6.0 vegan_2.6-8 labeling_0.4.3 [49] fansi_1.0.6 httr_1.4.7 polyclip_1.10-7 [52] abind_1.4-8 mgcv_1.9-1 compiler_4.4.1 [55] bit64_4.5.2 withr_3.0.2 doParallel_1.0.17 [58] backports_1.5.0 BiocParallel_1.40.0 carData_3.0-5 [61] viridis_0.6.5 DBI_1.2.3 highr_0.11 [64] ggforce_0.4.2 R.utils_2.12.3 ggsignif_0.6.4 [67] MASS_7.3-61 DelayedArray_0.32.0 rjson_0.2.23 [70] permute_0.9-7 tools_4.4.1 ape_5.8 [73] R.oo_1.26.0 glue_1.8.0 nlme_3.1-166 [76] GOSemSim_2.32.0 grid_4.4.1 reshape2_1.4.4 [79] cluster_2.1.6 fgsea_1.32.0 generics_0.1.3 [82] gtable_0.3.6 R.methodsS3_1.8.2 tidyr_1.3.1 [85] data.table_1.16.2 car_3.1-3 tidygraph_1.3.1 [88] utf8_1.2.4 XVector_0.46.0 ggrepel_0.9.6 [91] foreach_1.5.2 pillar_1.9.0 stringr_1.5.1 [94] yulab.utils_0.1.7 circlize_0.4.16 splines_4.4.1 [97] tweenr_2.0.3 treeio_1.30.0 lattice_0.22-6
[100] bit_4.5.0 tidyselect_1.2.1 GO.db_3.20.0
[103] ComplexHeatmap_2.22.0 locfit_1.5-9.10 Biostrings_2.74.0
[106] knitr_1.48 gridExtra_2.3 bookdown_0.41
[109] xfun_0.49 graphlayouts_1.2.0 visNetwork_2.1.2
[112] stringi_1.8.4 UCSC.utils_1.2.0 lazyeval_0.2.2
[115] ggfun_0.1.7 yaml_2.3.10 evaluate_1.0.1
[118] codetools_0.2-20 ggraph_2.2.1 tibble_3.2.1
[121] qvalue_2.38.0 BiocManager_1.30.25 ggplotify_0.1.2
[124] cli_3.6.3 munsell_0.5.1 jquerylib_0.1.4
[127] Rcpp_1.0.13 png_0.1-8 parallel_4.4.1
[130] ggplot2_3.5.1 blob_1.2.4 clusterProfiler_4.14.0
[133] DOSE_4.0.0 tidytree_0.4.6 viridisLite_0.4.2
[136] sigora_3.1.1 scales_1.3.0 purrr_1.0.2
[139] crayon_1.5.3 GetoptLong_1.0.5 rlang_1.1.4
[142] cowplot_1.1.3 fastmatch_1.1-4 KEGGREST_1.46.0 参考
https://journals.plos.org/ploscompbiol/article?id10.1371/journal.pcbi.1012422
