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Q1 什么是ChIP-Seq#xff1f;
ChIP-Seq即染…近段时间来我们合作的ChIP-Seq技术发表的高分成功案例一篇接一篇您是否心动了呢本篇文章总结了ChIP-Seq实验部分重点知识点开启ChIP-Seq的你绝不要错过
Q1 什么是ChIP-Seq
ChIP-Seq即染色质免疫共沉淀-高通量测序是指通过染色质免疫共沉淀技术ChIP特异性地富集与目的蛋白结合的DNA片段并对其进行纯化和文库构建然后对富集得到的DNA片段进行高通量测序是目前在全基因组水平研究蛋白结合靶DNA序列的重要手段为转录因子、组蛋白修饰等表观遗传学的研究提供有效方法。
Q2 ChIP-Seq实验流程 Q3 ChIP-Seq样本量要求 Q4 样本制备需要特别注意的点
1单文库样本量样本交联时甲醛的用量280μl、终浓度37%以及交联的时间10min一定要严格按照流程来
2甘氨酸用纯水现配现用使用之前一定要确保配好的甘氨酸没有结晶
3交联好的样本一定要液氮速冻后再转入-80°C保存
4做转录因子的ChIP-Seq必须准备交联的样本。
Q5 为什么要用甲醛交联
甲醛交联能更好的保存蛋白质与DNA的互作状态保存细胞原始状态下目的蛋白在染色体的定位确保信息不丢失。
Q6 ChIP-Seq如何设置对照各对照目的是什么
1input样本经过超声但是没有进行ChIP包含样本超声后总DNA可以进行电泳检测超声效果同时可以与最后ChIP样本进行比较看ChIP的效率如果用同一引物进行PCRChIP组和input组亮度差不多说明ChIP效率高基本上样本中所有的目的基因片段都被ChIP下来了反之说明效率低实验条件有待改进。设置input组是因为超声破碎过程中DNA的断裂不是随机的尤其是一些开放染色质区域在超声样本中优先累积已发表文章结果表明未经过IP的样本超声破碎后会产生数量不小的peaks。同时IP过程中会有非特异性结合的情况Input对照可以协助排除IP结果中的假阳性peaks。
2阴性对照用普通的IgG做为抗体理论上不会ChIP下来任何DNA片段因此作为阴性对照但是由于非特异结合或者实验过程中没发生结合的DNA清除不完全可能也会出现条带。目前做ChIP-seq其阴性对照组不会做后续高通量测序一般Qbit检测不到DNA浓度即判断为阴性对照结果良好。
Q7 抗体如何选择
一定要选择ChIP-seq级别抗体抗体研发成功后会进行WB、IP、IHC、ChIP-qPCR、ChIP-seq等实验并且标注在产品上。
Q8 没有ChIP-Seq级别的抗体可以用WB级别的么
不建议使用WB级别抗体做ChIP实验一个是WB抗体浓度低会破坏ChIP的体系一个是WB的蛋白是加热变性后的结构ChIP实验中最好用天然蛋白做的抗体去结合生理状体下的蛋白质。
Q9 实在没有合适抗体的情况下怎么办
1. 查文献获取成功用于ChIP-Seq的抗体
2. 可以考虑构建标签蛋白His、Flag、HA融合蛋白表达质粒目的蛋白和标签蛋白在受体材料中融合表达后利用标签特异性抗体捕获标签蛋白-目的蛋白—DNA复合物。
但是标签系统有一定的风险性
1可能存在标签蛋白分子量太大空间位阻影响目的蛋白和DNA的结合
2可能存在标签蛋白和DNA结合的风险
3内源性目的蛋白和标签目的融合蛋白竞争性结合DNA导致富集位点减少。
Q10 哪些网站可以查询抗体信息
1包含各个品牌的抗体网站https://www.citeab.com/#
2各个品牌的抗体产品官网
CSThttps://www.cellsignal.cn/
activemotifhttps://www.activemotif.com/
sigmahttps://www.sigmaaldrich.cn/CN/zh
NOVUShttps://www.novusbio.com/
abcamhttps://www.abcam.cn/
SANTAhttps://www.scbt.com/home
